Für Peter Parker (Tobey Maguire) alias Spider-Man läuft eigentlich alles wie am Schnürchen. Endlich hat er es geschafft sein Superhelden-Dasein mit seiner großen Liebe zu Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) unter einem Hut zu bringen. Alles läuft bestens: Die New Yorker lieben und feiern ihn, die Verbrechenrate scheint gegen Null zu streben und seine Beziehung zu MJ könnte kaum besser sein. Er spielt sogar mit dem Gedanken, sie um ihre Hand zu bitten. Doch der Schein trügt gewaltig, als sich Peters Anzug durch eine schwarze Substanz plötzlich ausnahmslos dunkel verfärbt. Anfänglich setzt der schwarze Anzug ungeahnte Kraftreserven frei, doch er verändert auch Peter. Nicht nur Rachesehnsüchte beherrschen ab sofort seine Gedanken, sein Ego wird immer größer und verändert seinen Charakter maßgeblich. Jene Menschen, die er vom tiefsten Herzen liebt, erkennen ihn nicht mehr wieder und werden durch seinen veränderten Charakter vor dem Kopf gestoßen. MJ fühlt sich immer mehr vernachlässigt und kann den alten, mitfühlenden Peter nirgends mehr in ihm erkennen. Sie findet Gehör bei jemand anderen. Als hätte Peter nicht schon Probleme genug, wird er auch noch im Job von dem Freelancer Eddie Brock (Topher Grace) ausgestochen, der die besseren Fotos von Spidey abliefert. Und zu guter Letzt bekommt die freundliche Spinne aus der Nachbarschaft es noch mit scheinbar unbezwingbaren Schurken zu tun: dem Sandman (Thomas Haden Church) und Venom ... und dann meldet sich auch noch der junge Kobold (James Franco) zurück.